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猪流行性腹泻病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒
发布时间:2022-04-03   

 

【注意】接到货后请认真阅读注意事项。

【用途】用于猪流行性腹泻病毒病的检测、诊断和流行病学调查。

【试剂】     

编号

数量

保存

SR-I

8mL

4

SR-II

14mL

4

TU-1

250uL

-20

TU-2

20uL

-20

TU-3

20uL

-20

TU-4

20uL

-20

TU-5

500uL

-20

TU-6

60uL

-20

TU-7

25uL

4

TU-8

30uL

4

T

500 uL

-20

【操作步骤】

1.RNA提取  

 

(1)取疑似猪流行性腹泻病毒病的病料(空肠、小肠及其内容物等),用Hank’sPBS研磨成13悬液,在-20 ℃反复冻融3次,经3 000 r/min离心分钟,上清液再经12 000 r/min离心15分钟,上清液-70 ℃保存备用。

(2)200uL上清液或标准品T,移入新的1.5mL灭菌EP管中,加入400uLSR-I,反复颠倒几次混匀,室温放置5~10分钟。

(3)加入200uL氯仿,漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。

(4)12000r/min离心10分钟,取上层水相(注意:切勿吸取到里两相之间的杂质),转移到一个新的EP管中,再加入等体积异丙醇混匀,室温放置10分钟。

(5)12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入SR-II 700uL,充分洗涤沉淀RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清(注意:严格防止RNA丢失)。

(6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II,室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解,即为模板,即用或-70冻存备用。

 

2.One-Step RT- PCR加样体系


 

 

 

3.反应程序


 

 

 

 

4.电泳

    称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5uLTU-8混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物5uL混合1uL TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3uLTU-6,在120v 电压下,1×TAE液中电泳15分钟,在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】

    在约240bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。                              

                                  1.DL2000 Marker      

                                  2.标准阳性片段

 

 

 

【注意事项】

1.每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。

2.本试剂盒为20头份量诊断试剂,操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况,不予负责。

3.所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。

4.尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染,RNA抽提严格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并经常更换。

5.加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况,不予负责。

6. 枪头、离心管和PCR管在使用前,最好用DEPC水(0.1%)处理,然后高压灭菌后烘干,操作过程尽量不要用手接触,可用镊子夹取。

7.注意防止试剂污染,在有效期限前用完。

8. TU-8所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。

【有效期】

本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。

【联系人】   王金良、管宇            电话:0543-3403060