【注意】接到货后请认真阅读注意事项。
【用途】用于猪瘟病毒病的检测、诊断和流行病学调查。
【试剂】
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编号 |
数量 |
保存 |
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SR-I |
8mL |
4℃ |
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SR-II |
14mL |
4℃ |
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TU-1 |
250uL |
-20℃ |
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TU-2 |
20uL |
-20℃ |
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TU-3 |
20uL |
-20℃ |
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TU-4 |
20uL |
-20℃ |
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TU-5 |
500uL |
-20℃ |
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TU-6 |
60uL |
-20℃ |
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TU-7 |
25uL |
4℃ |
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TU-8 |
30uL |
4℃ |
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T |
500 uL |
-20℃ |
【操作步骤】
1.RNA提取
(1) 取疑似猪瘟的病料（肾脏、淋巴结、脾脏、扁桃体）1~4g于无菌研钵，研磨并用Hanks液或PBS稀释成1：4乳剂，分装1.5ml灭菌EP管，反复冻融2~3次，8000r/min离心5分钟。
(2)取200uL上清液（或标准品Ｔ），移入新的1.5mL灭菌EP管中，加入400uLSR-I，反复颠倒几次混匀，室温放置5~10分钟。
(3)加入200uL氯仿，漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。
(4)12000r/min离心10分钟，取上层水相(注意：切勿吸取到里两相之间的杂质)，转移到一个新的EP管中，再加入等体积异丙醇混匀，室温放置10分钟。
(5)12000r/min离心10分钟，弃去上清，加入SR-II 700uL，充分洗涤沉淀RNA后，12000r/min离心5分钟，小心吸去上清（注意：严格防止RNA丢失）。
(6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II，室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解，即为模板，即用或-70℃冻存备用。
2.One-Step RT- PCR加样体系
3.反应程序
4.电泳
称量0.25g琼脂糖，放入锥形瓶，加入25mL 1×TAE液（可配置50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入1.5uL的TU-8混匀。封闭好电泳槽，加入梳子，倒入琼脂凝胶，待凝固后，将PCR产物5uL混合1uL TU-7，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加3uLTU-6，在120v 电压下，1×TAE液中电泳15分钟，在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】
在约510bp位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。
1.DL2000 Marker
2.标准阳性片段
【注意事项】
1.每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。
2.本试剂盒为20头份量诊断试剂，操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况，不予负责。
3.所有试剂在要求温度下保存，-20℃保存试剂尽量减少反复冻融，使用后的试剂立即放回，避免在室温搁置太久。
4.尽量建立PCR试验操作区，避免交叉污染，RNA抽提严格防止RNA酶污染，要求戴一次性塑料手套，并经常更换。
5.加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。
6. 吸头、离心管和PCR管在使用前，最好用DEPC水（0.1%）处理，然后高压灭菌后烘干，操作过程尽量不要用手接触，可用镊子夹取。
7.注意防止试剂污染，在有效期限前用完。
8. TU-8所装试剂为致癌物质，避免接触到皮肤。如若不甚接触，请立即用洗涤剂清洗。
【保存期】
本制品有效期为1年，生产日期见盒盖内侧。
【联系人】王金良、 管宇 电话：0543-3403060
仅供兽医诊断使用
